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试剂盒抽提大肠杆菌质粒——万融实验

【实验目的】

(1)了解什么是试剂盒及质粒抽提试剂盒的使用方法。

(2)掌握采用质粒抽提试剂盒小规模抽提大肠杆菌质粒DNA的方法及操作过程。

(3)熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的操作过程。

【实验原理】试剂盒是将完成1个项目所需要的各种试剂、材料组合在一起,方便实验人员使用的1种工具。由于分子生物学实验中用到的试剂种类繁多,配置要求较高,但用量较少,因此,通过试剂盒,可以减轻实验人员的工作量,而且保证实验结果的稳定。目前市场上用于质粒抽提的试剂盒很多,绝大部分试剂盒均在碱裂解法的基础上,利用硅胶柱吸附质粒DNA,去除杂质,之后用洗脱缓冲液将吸附的质粒DNA洗脱下来。此法所得的质粒DNA绝大部分为超螺旋DNA,纯度较高;同时,此法不需要使用酚、氯仿等有机溶剂,操作更为简便。本实验中,我们以上海生工公司生产的质粒小量抽提试剂盒为例,进行质粒DNA的抽提。

【实验材料、试剂及仪器】

1.实验材料含质粒pEG202的大肠杆菌DH5α(使用其他带氨苄青霉素抗性标记的质粒亦可)。

2.实验试剂

(1)LB液体培养基:10g细菌培养用胰蛋白胨(tryptone),5g细菌培养用酵母抽提物(yeastextract),10gNaCl,溶于800mL水中,加热溶解后,用10mol/LNaOH调节pH值至7.0,121℃高压灭菌20min,备用。

(2)50mg/mL氨苄青霉素溶液:1g氨苄青霉素溶于200mL水中,用0.22μm滤膜过滤除菌,分装至小管中,-20℃贮存。

(3)质粒小量抽提试剂盒:本实验使用上海生工生物工程技术服务有限公司生产的质粒小量抽提试剂盒(Cot.No.BS414-N)。试剂盒中包含RNaseA溶液、SolutionⅠ(溶液Ⅰ),SolutionⅡ(溶液Ⅱ)、SolutionⅢ(溶液Ⅲ)、WashSolution(洗涤溶液)、ElutionBuffer(洗脱缓冲液)、EZ-10Column(吸附柱)、2mLCollectionTube(收集管)。

(4)无水乙醇。

(5)琼脂糖凝胶电泳相关试剂。

3.实验仪器

台式高速离心机(每8人1台)恒温水浴锅(每8人1台)1.5mL无菌离心管(每人4支)移液器(每2人1套)1mL和200μL无菌吸头(每人10支)吸水纸(每4人1卷)琼脂糖凝胶电泳相关仪器

【实验步骤】

(1)将RNaseA溶液全部加入溶液Ⅰ中,均匀混合后4℃保存。

(2)在WashSolution中加入4倍体积的无水乙醇。

(3)从平板培养基上挑选单菌落接种至5mL含有50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中,37℃过夜培养,取1.5mL的过夜培养菌液,12000r/min离心2min,弃上清液。

(4)用250μLSolutionⅠ(含RNaseA),充分悬浮细菌沉淀,静置2min。

(5)加入250μLSolutionⅡ,轻轻地上下翻转五六次,至溶液呈澄清透明状。

(6)加入350μLSolutionⅢ,温和混匀,静置5min后,12000r/min离心10min。

(7)将试剂盒中的EZ-10Column置于CollectionTube上。将步骤(6)的上清液转移至EZ-10Column中,8000r/min离心2min,弃去滤液。

(8)在EZ-10Column中加入500μLWashSolution,10000r/min离心1min。

(9)重复步骤(8)。

(10)弃去滤液,10000r/min再离心2min,以充分去除WashSolution。

(11)将EZ-10Column转移到1个新的1.5mL离心管中,在EZ-10Column中加入50μLElutionBuffer,静置5min,10000r/min离心2min,离心管中所得即为质粒DNA。

(12)取5μL样品进行琼脂糖凝胶电泳检测(参照实验2)。

【实验注意事项】

(1)严格按照试剂盒说明书上的操作步骤进行,不可随意更改相关溶液体积及或离心时间、速度等。

(2)在将溶液加入EZ-10Column中时,枪头不要触碰硅胶膜。

(3)同实验11“实验注意事项”(1)和(2)。

【典型实验结果分析】理想实验结果(见图6.3)利用试剂盒抽提获得的大肠杆菌质粒一般纯度较高,没有RNA污染,绝大部分质粒都以超螺旋形式存在,因此,在电泳图谱上呈现1条清晰明亮的条带。

图6.3试剂盒抽提大肠杆菌质粒琼脂糖凝胶电泳结果M:DNA分子大小标准参照物;1~2:试剂盒法抽提得到的质粒pEG202

试剂盒抽提大肠杆菌质粒——万融实验

【实验讨论】问题:利用试剂盒法抽提大肠杆菌质粒时,能否通过提高大肠杆菌菌量提高质粒的产量?答:试剂盒法抽提大肠杆菌使用的菌量需参照说明书的要求,对一些细胞内拷贝数较少的质粒,可以适当提高大肠杆菌量,但同时需按比例提高溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的使用量。不过,由于吸附柱吸附的DNA的量是有限的,因此一旦吸附柱饱和,即使再提高菌量,也不能提高单个吸附柱上质粒的产量。